Изучение мутантных растений

Изучение мутантных растений, у которых вместо сложных листьев формируются простые, позволило генетикам из Великобритании, Германии и США частично расшифровать генетические основы эволюции формы листа. Ученым удалось превратить простые листья резуховидки Таля (Arabidopsis thaliana) в более сложные (лопастные), добавив в геном один-единственный ген RCO (REDUCED COMPLEXITY) сердечника шершавого (Cardamine hirsuta). Ген RCO экспрессируется в основаниях развивающихся выступов по краям зачатка листа и тормозит деление клеток в промежутках между выступами, что в итоге и делает лист лопастным или перистым. Ген RCO появился у крестоцветных в результате дупликации гена — регулятора развития цветов и листьев LMI1 (LATE MERISTEM IDENTITY 1). Ключевую роль в усложнении формы листа сыграли изменения регуляторной области гена RCO после дупликации. Ближайшие предки резуховидки Таля утратили ген RCO, а вместе с ним и сложные листья.

Расшифровать во всех деталях генетические основы эволюции сложного морфологического признака — задача крайне трудная даже на современном уровне развития науки. Каждый новый успех на этом пути — важное достижение, достойное освещения на страницах самых престижных научных журналов (и, конечно, на «Элементах»: см. ссылки в конце новости).

Международная команда генетиков сумела идентифицировать ген, сыгравший важную роль в эволюции формы листа у растений семейства капустных (или, как их называли раньше, крестоцветных). Главным объектом исследования был сердечник шершавый (Cardamine hirsuta). Лист у сердечника сложный, перистый, состоящий из нескольких боковых вторичных листочков и одного концевого. Растения обрабатывали мутагенным веществом — этилметансульфонатом. У одного из полученных мутантов произошло радикальное упрощение формы листьев: вторичные листочки редуцировались до небольших выступов по краю основного листа и пары лопастей у основания. При этом число первичных листьев и их расположение остались прежними.

Генетический анализ показал, что мутация вывела из строя гомеобоксный ген, который авторы назвали REDUCED COMPLEXITY (RCO, а сама мутация обозначается как rco). Сравнив геномы разных видов крестоцветных, ученые выяснили, что ген RCO появился в результате удвоения (дупликации) гена LMI1 (LATE MERISTEM IDENTITY 1). Гены, родственные LMI1, еще на ранних этапах эволюции цветковых растений взяли на себя роль регуляторов развития цветков и листьев. В частности, LMI1 необходим для формирования листьев с зубчатым краем (Saddic et al., 2006. The LEAFY target LMI1 is a meristem identity regulator and acts together with LEAFY to regulate expression of CAULIFLOWER).

Дупликация, породившая ген RCO, произошла у общих предков резуховидки и сердечника (и многих других крестоцветных, включая капусту) еще до их расхождения, но уже после отделения базальных (примитивных) крестоцветных, таких как крылотычинник (Aethionema), для которого характерны простые овальные листья.

У модельного растения резуховидки Таля (Arabidopsis thaliana) листья простые, а ген RCO отсутствует. Однако у другого вида того же рода, Arabidopsis lyrata, ген RCO есть, а листья более сложные, лопастные. Вся совокупность морфологических и генетических данных говорит о том, что вид A. thaliana с простыми листьями и без гена RCO произошел от предков, у которых ген RCO был, а листья имели более сложное строение.

Таким образом, авторы получили веские основания предполагать, что усложнение листьев у крестоцветных было связано с приобретением гена RCO, а их последующее упрощение у A. thaliana — с его утратой.

Каким образом появление RCO могло привести к усложнению листьев? Изначально RCO был всего лишь дубликатом старого гена LMI1, но потом накопил отличия как в белок-кодирующей, так и в регуляторной области. Проще всего предположить, что всё дело в увеличении производства белка, кодируемого геном LMI1 и его дубликатом, а имеющиеся различия между LMI1 и RCO не имеют существенного значения. Авторы проверили эту гипотезу, создав трансгенные растения с дополнительными копиями гена LMI1 (включавшими как белок-кодирующую, так и регуляторную части гена). Это ничего не дало: ни у сердечника с мутацией rco, ни у резуховидки Таля после такой генетической модификации форма листьев не усложнилась. Значит, RCO — не просто дополнительная копия LMI1. Он обладает своей спецификой, которая может быть заключена как в строении кодируемого белка (то есть в белок-кодирующей части гена), так и в том, где и когда ген включается (что определяется строением его регуляторной области).

Авторы изучили работу регуляторных областей LMI1 и RCO в зачатках листьев сердечника и резуховидки. Для этого к изучаемой регуляторной области приделывали бактериальный ген, включение которого окрашивает клетки в голубой цвет. Оказалось, что области экспрессии, определяемые регуляторными областями двух генов, сильно различаются. LMI1 экспрессируется на концах будущих вторичных листочков, которые закладываются как небольшие выступы на краю развивающегося листа, а RCO — в основаниях этих выступов. При этом LMI1 экспрессируется также в зачатках цветов и прилистников, тогда как работа RCO приурочена исключительно к основаниям вторичных листочков сложного листа. Области экспрессии LMI1 похожи у разных крестоцветных, включая вышеупомянутый крылотычинник.

Таким образом, изменения регуляторного участка гена RCO, произошедшие после его появления, изменили область его экспрессии по сравнению с исходной (предковой), характерной для LMI1. Это согласуется с предположением о том, что RCO после дупликации приобрел новую функцию, то есть произошла нео-функционализация.

Затем авторы проверили, влияют ли на новую функцию гена RCO особенности его белок-кодирующей части. Для этого они соединили кодирующую часть LMI1 с регуляторной частью RCO и вставили эту конструкцию в геном Cardamine hirsuta с мутацией rco. В результате простые листья растений-мутантов снова стали сложными. Это значит, что для формирования сложных листьев важны только особенности регуляторной части RCO. Белки, кодируемые генами RCO и LMI1, сами по себе остались взаимозаменимыми. Всё дело в приобретении геном RCO новой области экспрессии — в основаниях выступов листа, а не на их внешнем краю.

И вот пришло время решающего эксперимента. Если предположения авторов верны и листья у Arabidopsis thaliana упростились в связи с потерей гена RCO, то возвращение утраченного гена может привести к тому, что листья любимого цветочка генетиков снова усложнятся. Эксперимент был проведен и дал положительный результат.

Правда, листья у трансгенных A. thaliana не стали такими же сложными, как у C. hirsuta. Вторичные листочки не сформировались, вместо них получились лопасти. Очевидно, чтобы лопасти стали полноценными вторичными листочками с собственными черешками, кроме RCO нужно что-то еще: какие-то дополнительные генетические особенности, имеющиеся у сердечника и отсутствующие у резуховидки. Интересно, что точно такие же лопастные листья, как у трансгенных A. thaliana, характерны для другого представителя рода Arabidopsis — A. lyrata, в геноме которого сохранился ген RCO.

Дальнейшие опыты показали, что многие гомологи LMI1, взятые у разных представителей крестоцветных (и даже у некоторых других двудольных), вызывают формирование лопастных листьев у A. thaliana, если кодирующие участки этих генов объединить с регуляторным участком RCO. Это еще один довод в пользу того, что ключевое эволюционное новшество при формировании сложных листьев у крестоцветных состояло в изменении регуляторного участка RCO, тогда как свойства самих белков, кодируемых генами этого семейства, весьма консервативны.

Наконец, авторы попытались выяснить, каким образом RCO превращает простой лист с волнистым или зазубренным краем в лопастной или перистый. Для этого они сравнили динамику роста листовых зачатков у обычных растений C. hirsuta (с перистыми листьями) и у мутантов rco (с простыми листьями). В обоих случаях на краю листовой пластинки формируются небольшие округлые выступы, расположение которых контролируется гормоном ауксином. Концентрация ауксина максимальна на концах выступов. Распределение ауксина не различается у обычных растений и мутантов, а значит, RCO не влияет на это распределение (известно, что оно контролируется другими генами, такими как CUC и KNOX).

Дальнейший рост самих выступов протекает одинаково у обычных C. hirsuta и у мутантов rco. Однако в поведении клеток, расположенных в промежутках между выступами, наблюдаются контрастные различия. В норме у C. hirsuta эти клетки не делятся. Поэтому между растущими выступами формируются глубокие вырезы, а сами выступы в итоге становятся вторичными листочками. У мутантов rco клетки в промежутках между выступами активно делятся, поэтому край листового зачатка растет равномерно. В результате вместо перистого листа получается сплошная листовая пластинка с волнистым краем. Это значит, что ген RCO, экспрессирующийся в основаниях выступов, не столько ускоряет рост самих выступов, сколько подавляет деление клеток в промежутках между зонами своей экспрессии.

Таким образом, детали головоломки постепенно сложились в схему. Гены, родственные LMI1, скорее всего, начали служить ограничителями роста очень рано в эволюции цветковых растений. Например, известная мутация гороха tendril-less, при которой усики превращаются в листья, вызывается поломкой гена, гомологичного LMI1 (в норме этот ген ограничивает боковое разрастание усиков, не давая им превращаться в листья). К тому же авторы показали, что экспрессия LMI1 или RCO сразу во всех частях развивающегося растения приводит к резкому угнетению роста у A. thaliana.

У первых крестоцветных, унаследовавших LMI1 от своих предков и еще не имевших гена RCO, листья были простыми, как у крылотычинника (Aethionema). Затем произошла дупликация LMI1 с последующей нео-функционализацией одной из копий. Новая функция возникла благодаря изменению регуляторной части гена, что повлияло на область его экспрессии. Ген начал экспрессироваться в основаниях выступов развивающейся листовой пластинки. Это затормозило деление клеток в промежутках между выступами и привело к усложнению формы листа. В дальнейшем предки A. thaliana утратили RCO, что вызвало вторичное упрощение листа (как у C. hirsuta с мутацией rco). Однако в геноме A. thaliana сохранились все прочие необходимые компоненты программы развития сложного листа: не хватает лишь гена RCO (или любого похожего гена, управляемого регуляторной областью RCO). Если его искусственно вставить в геном A. thaliana, растение приобретает сложные лопастные листья, в точности как у родственного вида A. lyrata.

Скорее всего, тот же самый эффект мог быть достигнут и без генной дупликации — путем формирования в регуляторной области LMI1 новых энхансеров. Именно таким способом развивались узоры на крыльях дрозофил. В обоих случаях ключевую роль сыграли изменения регуляторных, а не кодирующих участков генов. По-видимому, это самый типичный путь формирования новых морфологических признаков. Гены, регулирующие морфогенез, как правило, многофункциональны. Причина в том, что в ходе эволюции к ним очень легко «привешиваются» новые функции — ведь эти гены фактически являются профессиональными переключателями, которым все равно, что переключать. Многофункциональность (плейотропность) регуляторов морфогенеза накладывает жесткие ограничения на эволюцию их кодирующих частей, потому что такие изменения приводят к множественным последствиям, большинство из которых наверняка будут вредными. Обойти эту проблему позволяют изменения регуляторных участков генов-регуляторов. При этом формируются новые области экспрессии гена-регулятора, что позволяет создать новую функцию, не вредя старым.